- 1
- 2
- 3
- 4
金鉆腳輪電泳技術(shù)
發(fā)表時(shí)間:2020/9/18 9:43:17
五種金鉆腳輪電泳技術(shù)的比較
SDSPAGE
名詞解釋：
相對(duì)遷移率（Rf）
問答題:
1.簡(jiǎn)述SDS-PAGE的基本原理。
2.影響SDS金鉆腳輪電泳的關(guān)鍵因素有哪些？ AGE
名詞解釋
1.遷移率
2.電滲
3.金鉆腳輪電泳
問答題
1.影響金鉆腳輪電泳遷移率的因素有哪些？
2.試述瓊脂糖凝膠金鉆腳輪電泳分離脂蛋白的原理。 CAME
1.CAME的基本原理是什么？
2.CAME分離血清蛋白金鉆腳輪電泳時(shí)應(yīng)注意哪些問題？ PAGE
名詞解釋
1.凝膠總濃度
2.交聯(lián)度
問答題
1.與CAME相比，PAGE有哪些特點(diǎn)。
2.試比較CAME與PAGE操作的區(qū)別。
3.簡(jiǎn)述不連續(xù)PAGE的原理。
1.瓊脂糖凝膠金鉆腳輪電泳Agarose Gel Electrophoresis
Gel Electrophoresis ：由瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠及聚丙烯酰胺等物質(zhì)作支持體的金鉆腳輪電泳。
特點(diǎn)（characteristic）：
1.可以制成非常均勻的凝膠，帶電質(zhì)點(diǎn)在凝膠的孔中泳動(dòng)。
2. 金鉆腳輪電泳操作方法簡(jiǎn)便，金鉆腳輪電泳速度快。
3. 分辨率高，重復(fù)性好，金鉆腳輪電泳圖譜清晰。
4. 適用于生化，免疫等定性定量測(cè)定。
（一）優(yōu)點(diǎn)（advantage)
1.因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲。
2.對(duì)蛋白質(zhì)吸附極微，故無拖尾現(xiàn)象。
3.凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒 等大分子物質(zhì)。
4.透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色。
5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測(cè)定。
6.有熱可逆性。
（二）缺點(diǎn)(disadvantage)
1.機(jī)械強(qiáng)度差，易破碎，濃度不能太低。
2.易被細(xì)菌污染，不易保存，臨用前配制。
3.瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散，金鉆腳輪電泳后必須立即固定染色。
4.與PAGE相比，分子篩(molecular sieve)作用小，區(qū)帶少。
應(yīng)用
1. 適用于大分子的核酸、核蛋白等的分離、鑒定及純化
2. 臨床生化檢驗(yàn)中常用于LDH、CK等同工酶的分離與檢測(cè)
3. 為不同類型的高脂蛋白血癥、冠心病等提供生化指標(biāo)
影響遷移的因素
瓊脂糖凝膠分離血漿脂蛋白
原理： 血清脂蛋白經(jīng)飽和蘇丹黑B預(yù)染后，以瓊脂糖凝膠為支持介質(zhì)，在pH8.6巴比妥緩沖液中金鉆腳輪電泳，根據(jù)各脂蛋白的組成、大小、形狀分離成不同區(qū)帶。
pH 8.6 > pI ，各種脂蛋白均帶負(fù)電，金鉆腳輪電泳時(shí)由負(fù)極到正極；VLDL為圓形，受阻力小，LDL形態(tài)不規(guī)則，受阻力大，所以VLDL跑在前。
加樣槽在負(fù)極，由負(fù)極到正極分別是CM\LDL\VLDL\HDL
2.醋酸纖維薄膜金鉆腳輪電泳Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME
特點(diǎn)：低吸附作用，低電滲作用，樣本用量少，親水性
1.Low sorption
2.Low electroosmosis
3.Small sample
4.Hydrophilic
金鉆腳輪電泳圖譜不齊
①點(diǎn)樣時(shí)血清點(diǎn)加不均勻
②薄膜局部干燥
③金鉆腳輪電泳時(shí)供給薄膜的液量不均勻或過少
④緩沖液變質(zhì)
⑤金鉆腳輪電泳時(shí)薄膜位置不正,與電流方向不平行
金鉆腳輪電泳圖譜分理不清
①點(diǎn)樣時(shí)血清點(diǎn)加不均勻
②薄膜局部干燥
③金鉆腳輪電泳時(shí)供給薄膜的液量不均勻或過少
④緩沖液變質(zhì)
⑤金鉆腳輪電泳時(shí)薄膜位置不正,與電流方向不平行
金鉆腳輪電泳速度慢
1. 濃縮效應(yīng)
1）凝膠層的不連續(xù)性
兩層凝膠T與C不同孔徑不同
濃縮膠孔徑大，分離膠孔徑小，蛋白質(zhì)在大孔徑濃縮膠中移動(dòng)，受阻力小，移動(dòng)速度快。
2）緩沖液離子成分的不連續(xù)性
甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3帶負(fù)電，朝正極移動(dòng)，進(jìn)入濃縮膠（pH6.7），甘氨酸解離度（）很小，有效遷移率（M ）很低，移動(dòng)速度較慢，稱為慢離子。
HCl 是強(qiáng)電解質(zhì)，=1，Cl-有效遷移率大，移動(dòng)速度快，稱快離子。
蛋白質(zhì)（pI＜6.0）帶負(fù)電荷，有效遷移率介于兩者之間。
3）pH值的不連續(xù)性
為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率，必須使?jié)饪s膠與分離膠之間pH值有所區(qū)別。
3.分子篩效應(yīng)與電荷效應(yīng)
進(jìn)入分離膠后，Gly-成為快離子
分離膠只有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，根據(jù)各蛋白質(zhì)所帶電荷不同、分子大小不同而分離
PAGE特點(diǎn)
1.具有分子篩效應(yīng)，分辨率高
2.樣品不易擴(kuò)散，用量少，靈敏度可達(dá)10-6g
3.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，分子結(jié)構(gòu)中富含酰胺基具有穩(wěn)定的親水基團(tuán)
4.凝膠不帶電荷，消除了電滲現(xiàn)象
5.機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，在一定濃度范圍內(nèi)無色透明
6.網(wǎng)孔可調(diào)節(jié) 4.SDSPAGE
十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS,also called lauryl sulfate)
是一種陰離子去污劑(anionic detergent )。
? 作用：破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)變性
(denature)而改變?cè)械臉?gòu)象;
? 保證蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。
原理
電流過低
供給薄膜的液量不足
緩沖液離子強(qiáng)度過高
薄膜中雜質(zhì)
白蛋白區(qū)帶中間部分不著色，染色不足
染色時(shí)間不夠、點(diǎn)樣過多
γ球蛋白向反方向移動(dòng)
電滲現(xiàn)象，可提高緩沖液液面或加大電流量以改進(jìn)
區(qū)帶一邊長一邊短呈扭曲現(xiàn)象
薄膜未緊壓在金鉆腳輪電泳槽的濾紙橋上，使薄膜接觸不良而增大了電阻。
區(qū)帶拖尾或區(qū)帶過于緊密
緩沖液離子強(qiáng)度＜0.05可出現(xiàn)區(qū)帶拖尾；離子強(qiáng)度＞0.075可出現(xiàn)區(qū)帶過于緊密。
血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜金鉆腳輪電泳Separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis
[原理] CAME是以醋纖膜（CAM）作支持物的一種區(qū)帶金鉆腳輪電泳技術(shù)。
將血清樣品點(diǎn)樣于醋纖膜上，在pH8.6的緩沖液中金鉆腳輪電泳時(shí)，血清蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷移向正極。由于血清中各蛋白組分等電點(diǎn)不同而致表面凈電荷量不等，加之分子大小和形狀各異，因而金鉆腳輪電泳遷移率不同，彼此得以分離。加樣：用加樣器蘸取血清約5ul，垂直印在CAM粗糙面，點(diǎn)樣區(qū)距離邊緣約1.5cm，金鉆腳輪電泳時(shí)點(diǎn)樣面朝下。加上槽蓋平衡5分鐘后再通電。電壓10~15V/cm膜總寬。金鉆腳輪電泳40~60分鐘，泳動(dòng)距離約達(dá)3.5~4cm時(shí)即可斷電。
由負(fù)極到正極可分為五條條帶
γ β α2 α1 白蛋白
3.聚丙烯酰胺凝膠金鉆腳輪電泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE
PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）單體和N，N＇-亞甲雙丙烯酰胺（N，N，N＇，N＇-methylene bisacrylamide，Bis）交聯(lián)劑通過自由基（ free radicals）聚合而成的一種多孔三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
過硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium persulfate，AP）作為催化劑，四甲基乙二胺（-N,N,N＇,N＇-tetramethylethylene diamine , TEMED）為加速劑。
?TEMED量多少都會(huì)影響催化作用，須在堿性條件下聚合
-分子氧存在，聚合不完全，須去除分子氧，隔絕氧
?升高溫度能提高聚合，降低溫度能延遲聚合
PAG孔徑的大小主要由Acr和Bis這兩種單體的濃度決定。可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的單體濃度。
Acr/Bis：20~40 完全透明且有彈性；
＜10 很脆，易碎，不透明；
＞100 糊狀不成形，易破碎
常用的標(biāo)準(zhǔn)凝膠是指濃度為7.5%的凝膠
交聯(lián)度C——Bis占單體與交聯(lián)劑總量的百分比。
C=b/（a+b）×100%
電極槽緩沖液通常為pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液
分離原理
（一）蛋白質(zhì)分子的解聚
樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的金鉆腳輪電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小(molecular mass of polypeptides )，而電荷因素可以被忽略。
1、SDS
陰離子去污劑(anionic detergent )
變性劑(denaturant)
助溶性試劑
斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵(hydrogen bond)
分子去折疊
破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)
2、強(qiáng)還原劑
巰基乙醇（β-mercaptoethanal）
二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）
使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵(disulfide bond)斷裂。
SDS和還原劑的作用：
（1）分子被解聚
（2）氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)
電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。
（3）蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超
過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除
了不同分子之間原有的電荷差異。
去污劑的選擇
無離子去污劑：Lubro W；Brij35， Tween
Triton
陽離子去污劑：cetyltrimethyl ammonium
bromide （CTAB）
cetylpyyridinium （CPC）
陰離子去污劑：SDS deoxycholate
金鉆腳輪電泳過程中的不正?，F(xiàn)象
（1）“微笑”現(xiàn)象
指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形，說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好。
2）“皺眉”現(xiàn)象
由于垂直金鉆腳輪電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。
（3）“拖尾”現(xiàn)象
樣品溶解不佳引起。
（4）“紋理”現(xiàn)象
由于樣品中的不溶顆粒引起的。
（5）偏斜現(xiàn)象
電極放置不平行引起或加樣位置偏斜而引起
（6）帶太寬
加樣量太多或加樣孔泄漏引起
分子量測(cè)定
1、相對(duì)遷移率（relative mobility ，Rf）
Rf即用每個(gè)帶的遷移距離除以溴酚藍(lán)前沿的遷移距離得到的。
測(cè)量位置應(yīng)在蛋白帶的中央。
蛋白帶遷移距離
Rf= ————————
溴酚藍(lán)遷移距離
蛋白帶遷移距離 固定前的凝膠長度
Rf= ————————— X —————————
干燥后的凝膠長度 溴酚藍(lán)遷移距離
2、作圖
以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，Rf為橫坐標(biāo)繪圖
3、通過測(cè)定未知蛋白質(zhì)的Rf值，便可在標(biāo)
準(zhǔn)曲線上讀出他的分子量
5.等電聚焦金鉆腳輪電泳Isoelectric Focusing Electrophoresis， IEFE
等電聚焦金鉆腳輪電泳(IEFE)是一種利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等點(diǎn)電(PI)不同的蛋白質(zhì)的金鉆腳輪電泳技術(shù)。
原理： 在金鉆腳輪電泳介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)，通電后，兩性電解質(zhì)會(huì)逐漸形成一個(gè)由正極到負(fù)極遞增的pH梯度，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)移動(dòng)并聚焦于與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置。
理想的載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具備的特征
①化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；
②分子量要小
→以便與被分離大分子物質(zhì)分離；
③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的緩沖能力
→梯度穩(wěn)定；
④兩性電解質(zhì)載體的數(shù)目要足夠多
→梯度平滑 ；
⑤對(duì)280nm的紫外光沒有或僅有很低的吸光度
→不影響測(cè)定。
優(yōu)點(diǎn)：
分辨率高（可達(dá)0.01pH單位）；
靈敏度高（最低檢出量達(dá)0.1ng）；
金鉆腳輪電泳區(qū)帶狹窄；
重復(fù)性好。
缺點(diǎn)：
要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀；
由于樣品中的成分會(huì)停留在其pI，不適用在pI不溶的蛋白質(zhì)。
IEFE應(yīng)用
1.分析分離制備蛋白質(zhì)、多肽
①區(qū)分人血清蛋白
②測(cè)出異常免疫球蛋白
③基因分型
④csf中寡克隆區(qū)帶的檢測(cè)
2.測(cè)定pI可鑒定蛋白質(zhì)、多肽
3.雙相金鉆腳輪電泳中，IEFE作為第一相
返回