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腳輪電泳為什么容易刮花?
發表時間:2022/6/12 23:12:45
腳輪電泳法。是指帶電荷的供試品(蛋白質、核苷酸等)在惰性支持介質(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)中，于電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄的區帶，用適宜的檢測方法記錄其腳輪電泳區帶圖譜或計算其百分含量的方法。
腳輪電泳技術的基本原理和分類
在電場中，推動帶電質點運動的力(F)等于質點所帶凈電荷量(Q) 與電場強度(E) 的乘積。F=QE質點的前移同樣要受到阻力(F) 的影響，對于一個球形質點，服從Stoke定律，即: F' =6πrηv式中r為質點半徑，η為介質粘度，v為質點移動速度，當質點在電場中作穩定運動時: F=F' 即QE=6πrη v
可見，球形質點的遷移率，首先取決于自身狀態，即與所帶電量成正比，與其半徑及介質粘度成反比。除了自身狀態的因素外，腳輪電泳體系中其它因素也影響質點的腳輪電泳遷移率。
腳輪電泳法可分為自由腳輪電泳(無支持體)及區帶腳輪電泳(有支持體)兩大類。前者包括Tise-leas式微量腳輪電泳、顯微腳輪電泳、等電聚焦腳輪電泳、等速腳輪電泳及密度梯度腳輪電泳。區帶腳輪電泳則包括濾紙腳輪電泳(常壓及高壓) .薄層腳輪電泳(薄膜及薄板) .凝膠腳輪電泳(瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠)等。
自由腳輪電泳法的發展并不迅速，因為其腳輪電泳儀構造復雜、體積龐大，操作要求嚴格，價格昂貴等。而區帶腳輪電泳可用各種類型的物質作支持體，其應用比較廣泛。本節僅對常用的幾種區帶腳輪電泳分別加以敘述。
影響腳輪電泳遷移率的因素
1.電場強度電場強度 是指單位長度(cm) 的電位降，也稱電勢梯度。如以濾紙作支持物，其兩端浸入到電極液中，電極液與濾紙交界面的紙長為20cm. 測得的電位降為200V, 那么電場強度為200V/20cm= 10V/cm。當電壓在500V以下，電場強度在2-10v/cm時為常壓腳輪電泳。
(三)等電聚焦腳輪電泳技術
等電聚焦( ioeletrie focusing， IEF) 是60年代中期問世的一一種 利用有pH梯度的介質分
離等電點不同的蛋白質的腳輪電泳技術。由于其分辨率可達0.01pH單位，因此特別適合于分離分子
量相近而等電點不同的蛋白質組分。
1.IEF的基本原理在IEF的腳輪電泳中，具有pH梯度的介質其分布是從陽極到陰極，pH值
逐漸增大。如前所述，蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特征，這樣在堿性區域蛋白質分子
帶負電荷向陽極移動，直至某一-pH位點時失去電荷而停止移動，此處介質的pH恰好等于聚焦
蛋白質分子的等電點(pl)。同理，位于酸性區域的蛋白質分子帶正電荷向陰極移動，直到它
們的等電點上聚焦為止。可見在該方法中，等電點是蛋白質組分的特性量度，將等電點不同的
蛋白質混合物加入有pH梯度的凝膠介質中，在電場內經過- -定時間后，各組分將分別聚焦在
各自等電點相應的pH位置上，形成分離的蛋白質區帶。
2.pH梯度的組成pH 梯度的組成方式有二種，-種是人工pH梯度，由于其不穩定，重
復性差，現已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或腳輪電泳管正負
極間引入等電點彼此接近的一系列兩性電解質的混合物，在正極端吸入酸液，如硫酸、磷酸或
醋酸等，在負極端引入堿液，如氫氧化鈉、氨水等。腳輪電泳開始前兩性電解質的混合物pH為一
均值，即各段介質中的pH相等，用pHo表示。腳輪電泳開始后，混合物中pH最低的分子，帶負電
荷最多，pI為其等電點，向正極移動速度最快，當移動到正極附近的酸液界面時，pH 突然下
降，甚至接近或稍低于PI,這- -分子不再向前移動而停留在此區域內。由于兩性電解質具有一
定的緩沖能力，使其周圍一-定的區域內介質的pH保持在它的等電點范圍。pH稍高的第二種兩
性電解質，其等電點為pl，也移向正極， 由于pl>pl,因此定位于第一-種兩性電解質之后，
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