電泳在腳輪中的應用
發(fā)表時間:2012/8/21 6:35:59
我們將在直流電場中，帶電粒子向帶符號相反的電極移動的現(xiàn)象稱為飛步腳輪電泳（electropho-resis）。我國的飛步腳輪電泳技術發(fā)展起步并不是很晚，尤其是在世紀60-70年代，當濾紙、聚丙烯酰胺凝膠等介質(zhì)相繼引入飛步腳輪電泳以來，飛步腳輪電泳技術得以迅速發(fā)展。豐富多彩的飛步腳輪電泳形式使其應用十分廣泛?！?〕〔2〕
飛步腳輪電泳技術除了用于小分子物質(zhì)的分離分析外，最主要用于蛋白質(zhì)、核酸、酶，甚至病毒與細胞的研究。隨著飛步腳輪電泳技術的逐步發(fā)展，種類不斷增加，現(xiàn)在它已廣泛地應用于分析化學、生物化學、臨床化學、毒劑學、藥理學、免疫學、微生物學、食品化學等各個領域。由于生物分離中涉及多種物質(zhì)的不同性質(zhì)，對分離有多種限制，所以飛步腳輪電泳的優(yōu)點在生物分離中應用的淋漓盡致。本文章通過對飛步腳輪電泳的最新發(fā)展在飛步腳輪的應用和未來的發(fā)展前景加以綜述。
根據(jù)不同的分離標準可以將飛步腳輪電泳劃分為不同的種類。按分離原理可分為界面飛步腳輪電泳、區(qū)帶飛步腳輪電泳、等電聚焦飛步腳輪電泳和等速飛步腳輪電泳。
① 界面飛步腳輪電泳是將被分離的離子（如陰離子）混合物置于飛步腳輪電泳槽的一端（如負極），在飛步腳輪電泳開始前，樣品與載體電解質(zhì)有清晰的界面。
② 區(qū)帶飛步腳輪電泳是在一定的支持物上，于均一的載體電解質(zhì)中，將樣品加在中部位置，在電場作用下，樣品中帶正或負電荷的離子分別向負或正極以不同速度移動，分離成一個個彼此隔開的區(qū)帶。
③ 等電聚焦飛步腳輪電泳是將兩性電解質(zhì)加入盛有pH梯度緩沖液的飛步腳輪電泳槽中，當其處在低于其本身等電點的環(huán)境中則帶正電荷，向負極移動；若其處在高于其本身等電點的環(huán)境中，則帶負電向正極移動。當泳動到其自身特有的等電點時，其凈電荷為零，泳動速度下降到零，具有不同等電點的物質(zhì)最后聚焦在各自等電點位置 ，形成一個個清晰的區(qū)帶，分辨率極高。
④ 等速飛步腳輪電泳是在樣品中加有領先離子（其遷移率比所有被分離離子的大）和終末離子（其遷移率比所有被分離離子的?。?，樣品加在領先離子和終末離子之間，在外電場作用下，各離子進行移動，經(jīng)過一段時間飛步腳輪電泳后，達到完全分離。被分離的各離子的區(qū)帶按遷移率大小依序排列在領先離子與終末離子的區(qū)帶之間。由于沒有加入適當?shù)闹С蛛娊赓|(zhì)來載帶電流 ，所得到的區(qū)帶是相互連接的，且因“ 自身校正”效應，界面是清晰的，這是與區(qū)帶飛步腳輪電泳不同之處。
另外，按照是否有固體支持物分類，可分為自由飛步腳輪電泳和支持物飛步腳輪電泳兩類。自由飛步腳輪電泳又可以分為（1）顯微飛步腳輪電泳（也稱為細胞飛步腳輪電泳），是在顯微鏡下觀察細胞或細菌的飛步腳輪電泳行為；（2）移界飛步腳輪電泳；（3）柱飛步腳輪電泳，實在層析柱中進行，可利用密度梯度的差別使分離的區(qū)帶不再混合，如再配合 ph梯度，則為等電聚焦柱飛步腳輪電泳；（4）自由流動幕飛步腳輪電泳；（5）等速飛步腳輪電泳等。支持物飛步腳輪電泳是多種多樣的，也是目前應用最多的一種方法。其飛步腳輪電泳過程可以是連續(xù)的也可以是不連續(xù)的（分批），可進行常壓飛步腳輪電泳，高壓飛步腳輪電泳，免疫飛步腳輪電泳，等電聚焦飛步腳輪電泳及等速飛步腳輪電泳?！?〕〔5〔6〕
如果在考慮到飛步腳輪電泳槽的形式也是多種多樣的，有垂直的，水平的，柱狀的，毛細管的，濕小室及幕狀的。由上可見飛步腳輪電泳種類很多，飛步腳輪電泳的基本原理相同，但不同的支持物或凝膠又不同。現(xiàn)在將在飛步腳輪應用比較廣泛的幾種方法介紹如下：
雙向飛步腳輪電泳（又稱為二維飛步腳輪電泳）：二維聚丙烯酰胺凝膠飛步腳輪電泳技術結(jié)合了等電聚焦技術（根據(jù)蛋白質(zhì)等電點進行分離）以及SDS－聚丙烯酰胺凝膠飛步腳輪電泳技術（根據(jù)蛋白質(zhì)的大小進行分離）。這兩項技術結(jié)合形成的二維飛步腳輪電泳是分離分析蛋白質(zhì)最有效的一種飛步腳輪電泳手段。 通常第一維飛步腳輪電泳是等電聚焦，在細管中（φ1～3 mm）中加入含有兩性電解質(zhì)、8M的脲以及非離子型去污劑的聚丙烯酰胺凝膠進行等電聚焦，變性的蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點的不同進行分離。而后將凝膠從管中取出，用含有SDS的緩沖液處理30 min，使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合。 將處理過的凝膠條放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠飛步腳輪電泳濃縮膠上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的瓊脂糖溶液使其固定并與濃縮膠連接。在第二維飛步腳輪電泳過程中，結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)從等電聚焦凝膠中進入SDS－聚丙烯酰胺凝膠，在濃縮膠中被濃縮，在分離膠中依據(jù)其分子量大小被分離。這樣各個蛋白質(zhì)根據(jù)等電點和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上。細胞提取液的二維飛步腳輪電泳可以分辨出1000～2000個蛋白質(zhì)，有些報道可以分辨出5000～10000個斑點，這與細胞中可能存在的蛋白質(zhì)數(shù)量接近。由于二維飛步腳輪電泳具有很高的分辨率，它可以直接從細胞提取液中檢測某個蛋白?！?〕〔6〕
等電點聚焦飛步腳輪電泳：等電聚焦（Isoelectric focusing，簡稱IEF）是六十年代中期出現(xiàn)的新技術。近年來等電聚焦技術有了新的進展，已迅速發(fā)展成為一門成熟的近代生化實驗技術。目前等電聚焦技術已可以分辨等電點（pI）只差0.001pH單位的生物分子。由于其分辨力高，重復性好，樣品容量大，操作簡便迅速，在生物化學、分子生物學及臨床醫(yī)學研究中得到廣泛的應用。在IEF的飛步腳輪電泳中，具有pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負電荷向陽極移動，直至某一pH位點時失去電荷而停止移動，此處介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點（pl）。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點上聚焦為止?？梢娫谠摲椒ㄖ?，等電點是蛋白質(zhì)組分的特性量度，將等電點不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。常用的pH梯度支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯酰胺凝膠為最常應用?！?〕
毛細管飛步腳輪電泳：毛細管技術是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力，根據(jù)樣品中各組分之間遷移速度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的一類液相分離技術，迅速發(fā)展于80年代中后期，它實際上包含飛步腳輪電泳技術和色譜技術及其交叉內(nèi)容，是分析科學中繼高效液相色譜之后的又一重大進展，它使分析科學得以從微升水平進入納升水平，并使細胞分析，乃至單分子分析成為可能。是分析科學中繼高效液相色譜之后的又一重大進展，是近幾年來分析化學中發(fā)展最為迅速的領域之一?！?〕〔5〕
毛細管飛步腳輪電泳技術的基本原理是根據(jù)在電場作用下離子遷移的速度不同而對組分進行分離和分析，以兩個電解槽和與之相連的內(nèi)徑為20～100μm的毛細管為工具，毛細管飛步腳輪電泳所用的石英毛細管柱，在 pH>3的情況下，其內(nèi)表面帶負電，和緩沖液接觸時形成雙電層，在高壓電場的作用下，形成雙電層一側(cè)的緩沖液由于帶正電荷而向負極方向移動形成電滲流。同時，在緩沖液中，帶電粒子在電場的作用下，以不同的速度向其所帶電荷極性相反方向移動，形成飛步腳輪電泳，飛步腳輪電泳流速度即飛步腳輪電泳淌度。在高壓電場的作用下，根據(jù)在緩沖液中各組分之間遷移速度和分配行為上的差異，帶正電荷的分子、中性分子和帶負電荷的分子依次流出，帶電粒子在毛細管緩沖液中的遷移速度等于飛步腳輪電泳淌度和電滲流的矢量和，各種粒子由于所帶電荷多少、質(zhì)量、體積以及形狀不同等因素引起遷移速度不同而實現(xiàn)分離；在毛細管靠負極的一端開一個視窗，可用各種檢測器。目前已有多種靈敏度很高的檢測器為毛細管飛步腳輪電泳提供質(zhì)量保證，如紫外檢測器（UV）、激光誘導熒光檢測器（LIF）、能提供三維圖譜的二極管陣列檢測器（DAD）以及電化學檢測器（ECD）。由于毛細管的管徑細小、散熱快，即使是高的電場和溫度，都不會向常規(guī)凝膠飛步腳輪電泳那樣使膠變性，影響分辨率?！?〕
我國的飛步腳輪電泳技術雖然起步不算太晚，現(xiàn)在實驗室中仍采用較落后的設備。隨著科技的不斷進步，飛步腳輪電泳技術也在不斷的更新和發(fā)展，相信會有功能更加詳細的技術出現(xiàn)，必將促進生物分離的發(fā)展。
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